乙醇含量測試盒說明書（微量法）

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

酒是含酒精（乙醇）飲料的統稱，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒質量的重要指標之一。我國是世界上最早發明釀酒的國家，也是酒類產品消費大國，其消費量居世界之首。因此， 快速、準確測定酒中乙醇含量，對于確保酒的質量和保護消費者的健康具有重大意義。

測定原理：

乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛，同時，NAD 被還原生成 NADH，NADH 在1-mPMS 的作用下使 WST-8 顯橙黃色，通過 450 nm 下測定吸光值變化可測得乙醇含量。

需自備的儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96 孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 12 mL×1 瓶,4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶, -20℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑三充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

試劑三：液體 10 mL×1 瓶,4℃保存；

試劑四：液體 1.5mL×1 管， 4℃避光保存。

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1、組織：按照組織質量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 蒸餾水），進行勻漿，8000g，25℃離心 10min，取上清待測。

2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：蒸餾水體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 蒸餾水）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）， 8000g，25℃ 離心 10min，取上清待測。

3、血清（漿）等液體樣品：直接測定。

測定步驟：

1、酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 450nm。

2、工作液的配制：臨用前按照樣本數量，按以下比例配制工作液

3、樣本測定

按下表在 96 孔板中加入如下試劑

混勻后記錄 450nm 下測定初始吸光值 A1，和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2，計算△A=A2-A1。

乙醇含量計算：

標準條件下測定回歸方程為 y = 0.0256x + 0.0055 R2 = 0.9991； x 為乙醇含量（μmol/mL），y 為吸光值差值△A。

按照血清（漿）體積計算

乙醇含量（μmol/mL）= (△A-0.0055)÷0.0256=39.1×(△A-0.0055)

按照樣品質量計算

乙醇含量（μmol/g 鮮重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）

= 39.1×(△A-0.0055)÷W

按照細菌或細胞密度計算

乙醇含量（μmol/104 cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.078×(△A-0.0055)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.04mL；V2：加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬；

注意事項：

測定前取 1-2 個樣做預實驗，若△A﹥0.3 或乙醇含量﹥10μmol/mL，需將樣本用蒸餾水稀釋后再測定，以確保測定的準確性。

最低檢測限：0.02μmol/mL。